细菌 环二鸟苷酸（c-di-GMP）ELISA试剂盒处理及保存方法

                                         细菌（Bacteria）环二鸟苷酸（c-di-GMP）ELISA检测试剂盒
检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被环二鸟苷酸（c-di-GMP）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并全部洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的环二鸟苷酸（c-di-GMP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟
取上清。
5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.   试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶全部溶解后再使用。

2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.   浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.   所有液体组分使用前充分摇匀。注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、100、200、400、800、1600 ng/mL
   试剂的准备
    20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
   洗板方法

6.   手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

7.   自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

8. 操作步骤

9.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

10.   设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

11.   样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

12.   除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

13.   弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

14.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

15.   每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

16. 结果判断
     绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

17. 试剂盒性能

18.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

19.  灵敏度：最少检测浓度小于1.0 ng/mL。

20.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

21.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

22.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

23.  有效期：6309个月

24. 免责声明
      试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或细菌体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

25.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。